浅谈WB实验中的胶片转移过程

  • 免疫印迹,也称为蛋白质印迹,是基于抗原和抗体的特异性结合检测复杂样品中的特定蛋白质的方法。
    Western blot是一种基于凝胶电泳和固相免疫分析的新型免疫化学技术。
    由于SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和灵敏性,蛋白质印迹已成为蛋白质分析的常规技术。
    Western印迹通常用于鉴定特定蛋白质并进行定性和半定量蛋白质分析。
    主要实验程序如下。
    蛋白质提取实验是该组织的样品,它需要一个新鲜组织样品或妥善保存适当的量(250?500毫克)的组织样品,并添加1毫升(或试剂提取)的总蛋白提取试剂。它含有蛋白酶抑制剂和均质化的全蛋白提取物(或核蛋白)。
    实验对象是细胞样品,从每个样品中收集1×10 6 -1×10 7个细胞。用PBS洗涤细胞,并加入到PBS + 0中。
    含有蛋白酶抑制剂的1ml至1ml总蛋白质提取试剂(或核蛋白质提取试剂)提取总蛋白质(或核蛋白质)。
    2
    蛋白质定量:通过操作BCA蛋白质定量试剂盒说明书确定样品浓度。
    3
    变性聚丙烯酰胺分批凝胶电泳(SDS?PAGE):将制备的样品溶液和先前染色的蛋白质标记分别加载,将标准品加入到*孔中,并通过电泳分离蛋白质。。
    4
    将蛋白质转移到PVDF膜上,根据Bio?Rad蛋白质转移装置组装滤纸凝胶的中间层,并在4℃恒定流量30mA下转移过夜。。

    蛋白质印迹膜和抗体孵育将阻断膜在5%脱脂乳溶液中在室温下温育1小时以阻断膜中的非特异性结合。
    将封闭的膜加入到一抗中以在室温下孵育1。
    抗原 - 抗体结合5小时。
    加入HRP标记的双抗体以结合第一抗体,并将膜在室温下温育1小时。
    通过添加HRP标记的GAPDH抗体可以同时检测GAPDH的含量。
    6
    通过化学发光检测Western印迹的结果,并将膜与化学发光底物一起温育并暴露于膜X.
    将图像扫描存储为计算机文件,并通过GIS1000分析软件将图像中每个特定条带的伽玛值数字化。
    7
    蛋白质印迹数据分析:为了纠正错误,将目标蛋白质的灰度值除以内部参考GAPDH /肌动蛋白的灰度值,结果代表样品中目标蛋白质的相对含量。
    8
    它提供了实验报告,包括详细的实验方法和免疫印迹实验结果的相关数据。


发表时间:2019-06-30

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